2. 称取 2g琼脂糖放于 250mL的锥形瓶中

　　原标题：猪蓝耳病变异株检测试剂盒

　　猪蓝耳病（Nsp21594～1680变异株）RT-PCR检测试剂盒

　　英文名称：Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome（PRRS）Nsp21594～1680variantstrainRT-PCRTestKit

　　【包装规格】10份/盒、40份/盒

　　【预期用途】

　　【检测原理】

　　利用吸附柱提取 RNA 作为模板，在反转录酶的作用下，以引物为起点合成与RNA模板互补的 cDNA 链；然后在 DNA聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火和中温延伸的多次循环，使特异 DNA片段的拷贝数放大数百万倍。将扩增的 DNA片段进行电泳、染色后，在紫外灯下，肉眼可见DNA片段的扩增带。

　　【储存条件及有效期】

　　储存条件详见【主要组成成份】，本试剂盒有效期为 6个月。

　　【适用仪器及材料】

　　1. 设备：分析天平、离心机（12000转/分钟）、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、微波炉、-20℃冰箱。

　　2. 器材：眼科剪、眼科镊、组织研磨器（研钵或匀浆器）、一次性注射器、可调移液器（2.5μL、20μL、200μL、

　　1000μL）、1000mL量筒、250mL锥形瓶、计时器。

　　3. 耗材及试剂：生理盐水、琼脂糖、DNAMarker、无 RNA酶的 1.5mL离心管和吸头（10μL、200μL、1000μL）、灭菌蒸馏水。

　　【样品要求】

　　1. 病死或扑杀的猪，取肺、扁桃体和脑等组织。

　　2. 待检活猪，用注射器取血 5mL。

　　3. 立即检测或短期内 2～8 ℃保存，避免反复冻融。

　　【检验方法】

　　一、样品制备

　　1. 组织样品的处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约 1g，用手术剪剪碎混匀后取 0.1g于研磨器中磨碎，再加 1mL生理盐水继续磨至无块状物；然后将样品转至 1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心 2min，取 200μ L 上清于 1.5 mL灭菌离心管中。

　　2. 全血样品的处理：待血凝后取 200μL血清于 1.5mL灭菌离心管中。

　　3. 阳性对照的处理：混匀后，8000rpm离心 2min，取 200μL上清于 1.5mL灭菌离心管中。

　　4. 阴性对照的处理：取 200μL于 1.5mL灭菌离心管中。

　　二、病毒 RNA 的提取

　　1. 往裂解液中加入 BME77.6μL（10T）或 291μL（40T），充分混匀。（加入了 BME的裂解液须置于 4℃保存）

　　2. 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入 600μL裂解液，上下颠倒混匀 8～10次，室温静置 10min。

　　3. 加入 600μL异丙醇，上下颠倒混匀 5次。

　　4. 吸取 650μL混合液转入吸附柱，12,000rpm离心 45s，弃去收集管中液体，套回收集管。

　　5. 重复步骤 4。

　　6. 向吸附柱中加入 600μL洗涤液，12,000rpm离心 45s，弃去收集管中液体，套回收集管。

　　7. 重复步骤 6。

　　8. 空柱 12,000rpm离心 2min。

　　9. 将吸附柱移入新的无 RNA酶的 1.5mL离心管中，在吸附柱膜中央加入 25μL洗脱液，室温静置 1min，12,000rpm

　　离心 45s，获得总 RNA。立即检测或-20℃保存。三、RT-PCR

　　1. 反应体系配制：每份总体积 20μL，分别取 16.8μLRT-PCR反应液 A（用前混匀）、1.2μLRT-PCR反应液B和

　　2μL模板 RNA，混匀。最后加入 20μL 矿物油覆盖（有热盖的 PCR仪不用加矿物油），作好标记。

　　2. 反应程序：在 PCR仪上运行以下程序：42℃ 45min，94℃ 3min；循环 94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s，共

　　35次；72℃延伸 10min。四、电泳

　　1. 量取 20mL50倍TAE电泳缓冲液，用双蒸水稀释至 1000mL。

　　2. 称取 2g琼脂糖放于 250mL的锥形瓶中，加入 100mL 稀释好的 TAE电泳缓冲液，微波炉加热溶解，稍稍冷却后加入 10μL 染色液混匀，倒入插有梳子的制胶板中。

　　3. 待胶凝固后，上样孔端放在电泳槽负极。取 10μLPCR产物点样于上样孔中，同时点DNAMarker作为参照，以

　　90～120V的电压于稀释好的 TAE电泳缓冲液中电泳，待溴酚兰指示剂电泳至凝胶中下部时结束电泳，在紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）上观察结果。

　　【参考值】阳性对照出现 278bp扩增带，阴性对照在目标位置无带出现时，实验结果成立。

　　【检验结果的解释】

　　被检样品出现 278bp或 200bp 扩增带为猪蓝耳病（Nsp21594～1680变异株）阳性，否则为阴性。

　　【检验方法的局限性】本试剂盒仅用于定性检测。

　　【注意事项】

　　1. 各试剂须在规定的温度储存。

　　2. 本试剂盒有效期为 6个月，不要使用超过有效期的试剂。

　　3. 严格遵守说明书操作，可以获得最好的实验结果，移液、定时等全部过程必须精确。

　　4. 保存于-20℃的试剂使用前须完全融化，并充分混匀，8000rpm离心 15s，使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取，使用后立即放回-20℃。

　　5. 反复冻融试剂将降低检测的灵敏度，建议 3次内用完。

　　6. 注意防止试剂盒组份受污染，不同试剂盒之间的组份不要混用。

　　7. RNA提取过程中，须戴口罩、勤换手套，尽量缩短操作时间，避免 RNA酶污染。

　　8. BME 和染色液含有对人体有害的物质，室温下避光保存，且避免直接接触。

　　【生产企业】

　　企业名称：广州市华南生物工程有限公司

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